基本信息

项目名称:
定点诱变抗菌肽(Protegrin)基因的研究
小类:
生命科学
简介:
本研究根据已报道的Protegrin基因序列设计了3’端互补的引物,在引物中引入突变位点,利用拼接PCR方法,扩增获得定点诱变的突变体基因pg-g,利用表达载体pET-28a将突变基因pg-g转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,其表达产物对大肠杆菌的抑菌效果有明显提高。
详细介绍:
随着抗生素的广泛和长期使用,耐药性微生物的不断产生和扩展使得对感染性疾病的控制变得更加艰难,全新的抗生素研究成为当前许多医药专家的主攻目标。在近几年的研究中,人们发现一类短的多肽类物质——抗菌肽对各种细菌能产生较强的杀灭作用,且能抑制分支杆菌、螺旋体、披膜病毒、寄生虫等多种病原生物。除此以外,抗菌肽还具有抗肿瘤的特性;在免疫反应过程中还起着调理素的作用。 Protegrin是Cathelicidins家族中的一种富含碱性氨基酸的阳离子小肽,仅含有16-18个氨基酸,具有广谱的抗菌活性及独特的抗人类HIV病毒的生物学功能。其抑菌机制主要是依赖带正电荷的精氨酸与靶菌表面的带负电荷的位点结合,通过Protegrin分子的两性结构插入细胞膜中,破坏细胞膜的结构,从而发挥抑菌作用。Protegrin是目前国际上研究得比较深入的抗菌肽之一,其研究主要集中Protegrin抗菌肽及其结构类似物的作用机制和开发应用方面,而国内还没有对其的相关报道。根据已有研究结果表明,抗菌肽Protegrin是一种非常有应用价值和开发前途的新型抗菌物质。 天然提取的抗菌肽直接在实际中应用效果往往不很理想,因此人们常常对抗菌肽进行一定程度上的人工改造,以适应生产生活的应用。目前对于抗菌肽的开发大都是采用人工合成的方法,成本高且不能完全保证合成单一的纯肽。我们通过对抗菌肽Protegrin的氨基酸组成和作用机理分析,并根据已报道的Protegrin基因序列设计了3’端互补的引物,利用拼接PCR扩增获得定点诱变的突变体基因pg-g,其编码蛋白的C末端相对于野生型增加一个非极性氨基酸Gly,整个分子的两性结构有所提高,分子跨膜能力也应相应增强。利用表达载体pET-28a将突变体基因pg-g转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE检测表明目的蛋白得到成功表达。通过对表达产物进行抑菌实验发现,定点突变基因pg-g表达产物对大肠杆菌的抑菌效果有明显提高。

作品专业信息

撰写目的和基本思路

抗菌肽Protegrin具有广谱的抗细菌、真菌及HIV病毒特性。目前针对Protegrin的研究在国际上已成为热点,而国内还没有相关报道。因此,本文对Protegrin基因进行了初步诱变改良研究。 本研究对Protegrin基因进行定点诱变、在工程菌中高效表达,最终获得抑菌效果更加明显的突变基因。本研究成果为了解抗菌肽结构功能关系与研发抑菌效果更好的抗菌肽制品提供了理论依据。

科学性、先进性及独特之处

1.获得Protegrin新型突变基因,其表达产物对大肠杆菌具有更加明显抑制作用。 2.目前抗菌肽研究普遍采用直接人工合成方法。本研究对Protegrin基因采用PCR定点突变、工程菌中诱导表达,获得改良抗菌肽。与人工合成方法相比更为省时简便,使得利用微生物法大规模生产该类抗菌肽成为可能。 3.对Protegrin基因诱变方法采用了拼接PCR法,实验流程简单、省时、成本低廉而且准确性更高。

应用价值和现实意义

1.通过对突变型和野生型抗菌肽的抑菌功能研究,可以探究抗菌肽发挥作用的机理,更加清晰地了解抗菌肽结构和功能间的内在关系,为抗菌肽新药物的研发和临床应用打下理论基础。 2.获得抑菌效果增强的改良Protegrin基因,并摸索出在工程菌高效表达的条件,为最终实现该类抗菌肽的微生物大规模生产奠定基础。 3.摸索出一条Protegrin抗菌肽研究的新方法,操作更为简便,更贴近于实际应用。

学术论文摘要

本研究通过对抗菌肽Protegrin成熟肽的氨基酸组成和作用机理分析,并根据已报道的Protegrin基因序列设计引物,PCR扩增获得定点诱变的突变体基因pg-g,其编码蛋白的末端相对于野生型增加一个非极性氨基酸Gly。利用表达载体pET-28a将突变体基因pg-g转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE检测表明目的蛋白得到成功表达。通过对表达产物进行抑菌实验发现,定点突变基因pg-g表达产物对大肠杆菌的抑菌效果有明显提高。

获奖情况

本研究论文拟发表在中文核心期刊《河北师范大学学报(自然科学版)》2009年33卷第四期(已接受排版,于7月正式发表)。

鉴定结果

参考文献

[1]QU X D, Harwig S S, Shafer W M, et al. Protegrin structure and activity against Nesseria gonorrhoeae [J]. Infectinon and Immunity, 1997, 65(2): 636-639. [2]OSTBERG N, KAZNESSIS Y. Protegrin structure-activity relationships: using homology models of synthetic sequences to determine structural characteristics important for activity [J]. Peptides, 2005, 26(2): 197-206. [3]CHEN J, FALLA T J, LIU H, et al. Development of protegrins for the treatment and prevention of oral mucositis: structure-activity relationships of synthetic protegrin analogues [J]. Biopolymers, 2000, 55(1): 88-98. [4]GIDALEVITZ D, ISHITSUKA Y, MURESAN A S, et al. Interaction of antimicrobial peptide protegrin with biomembranes [J]. PNAS, 2003, 100(11): 6302. [5]孙艳华, 张楠. 抗菌肽protegrin的开发现状与作用机制研究[J]. 中国现代应用药学杂志, 2007, 24(5): 366-369. [6]周鹏, 董克家. 利用套叠PCR技术进行基因突变和拼接[J]. 生命科学研究, 2001, 5(1): 52-55.

同类课题研究水平概述

抗菌肽对各种细菌都能产生较强的杀灭作用,且能抑制分支杆菌、螺旋体、披膜病毒、寄生虫等多种病原生物。研究也发现,抗菌肽附着在细菌表面后,除了本身对细菌的损伤外,还可以使细菌被吞噬细胞吞噬消化,起到调理素的作用。除此以外,抗菌肽还选择杀伤肿瘤细胞,具有抗癌抗肿瘤的特性。天然提取的抗菌肽直接在实际中应用效果往往不很理想,因此人们常常对抗菌肽进行一定程度上的人工改造,以适应生产生活的应用。 Kim 等根据天然抗菌肽序列,通过增减或替换氨基酸的方法设计出抗菌肽GGN6 ,可以诱导癌细胞凋亡, 对具有耐药性的乳腺癌细胞系MCF27 有明显的毒性作用;王志兴等把大麦α-2淀粉酶的信号肽序列和抗菌肽cecropin B 基因或hhiva A 基因构成嵌合基因,并把此基因导入马铃薯,结果加信号肽序列的cecropin B 转基因植株发青枯病延迟,病情指数降低;国外学者Sawai等在保留两亲螺旋结构的前提下进行单碱基突变,结果克服了抗菌肽visp irinO1对红细胞的溶血性,并提高了抗菌活性。 目前对抗菌肽药物的研究,普遍采用在多肽水平上用人工合成改造的方法对抗菌肽进行结构修饰,达到改变其抗菌的效果,方法复杂,成本较高,效果有限,不易进行大规模开发生产。通过PCR介导定点突变DNA片段可以达到改造蛋白结构的目的,与人工合成肽的方法相比省时简便,同时还可为用微生物法大规模生产重组蛋白提供一定的技术支持。据此,本实验通过引物互补结合拼接PCR技术,对Protegrins进行体外定点突变,最终获得了抑菌效果明显增强的改良抗菌肽基因。 相信上述研究成果,将拓宽抗菌肽的应用领域,产生明显的社会效益,具有广阔的应用前景。
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