基本信息
- 项目名称：
- 空调制冷系统中致病军团菌快速检测
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作B类
- 简介：
- 本作品基于环介导等温扩增技术，构建了一种特异性强、灵敏度高、检准率高的检测平台来快速检测空调制冷系统中的军团菌。与传统的军团菌检测方法与PCR检测方法相比，本作品体现出以下几个创新点：I.快速、高效扩增；II.高灵敏度，高特异性；III.无需增菌；IV. 鉴定简便。
- 详细介绍：
- 本项目研究的目的在于，开发一种基于LAMP技术的军团菌快速诊断试剂盒，使用该试剂盒，和一些简单的仪器，在2小时之内，可以在现场对空调制冷系统中的军团菌进行快速诊断，根据反应之后反应液所呈现的颜色（橙色为阴性、绿色为阳性）用肉眼即可对结果进行观察。同时可以区分出提供样本中的军团菌，属于嗜肺军团菌，还是非嗜肺军团菌，由于导致军团病的主要致病菌为嗜肺军团菌，因此区分嗜肺和非嗜肺军团菌具有重要意义，而且这是传统方法无法达到的。该方法大大节省了检测周期，将原先得检测周期由1周缩短至2小时，这点对于预防军团病的爆发具有重要意义。 计划解决的关键问题： 1）LAMP反应需要4条引物，且引物设计要求严格，且设计过程十分复杂，对军团菌目标基因的选择上（如保守区或变异区）是关系到检测特异性的关键问题，此外如何在分子水平上区分导致军团病的嗜肺军团菌和其他不治病的军团菌，对于提高检测准确度有重要意义。该问题将通过大量基因组比对解决。 2）由于所检测的对象处于复杂生物体系中，其中的一些成分对反应的最终结果 起到至关重要的影响，如何在复杂的体系中灵敏特意的诊断致病菌，减少非特异性扩增反应，避免复杂成分抑制反应。该技术问题将通过样品的前处理条件的摸索于改善解决。 3）LAMP反应体系是一个复杂体系，反应液由多种试剂构成，而这些试剂的用量和比例，对于反应特异性的发生，具有十分关键的作用。该技术问题将通过正交试验解决。 思路方法： (1) 运用生物信息学方法对军团菌（主要为嗜肺军团菌）的基因片段（如16sRNA或mip等）进行分析。 （2）在靶基因序列基础上设计特异引物，使之能区军团菌和嗜肺军团菌。 （3）在军团菌菌特异基因区段设计六条四对LAMP检测引物。 （4）使用嗜肺军团菌菌株，提取DNA，并对DNA进行LAMP扩增反应，验证和优化反应体系 （5）待测样本的获得与处理，阳性对照阴性对照的准备。 （6）进行LAMP扩增，和传统方法进行对比。
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 对于环境中的军团菌的检测，传统的以平板培养为基础的检测军团菌的前期方法操作繁琐、时间长、对培养条件要求苛刻，检测成本高。当前军团菌鉴定多采用PCR技术取代复杂、费时的传统生化方法，但在该技术应用中需要配套相对昂贵的试剂和仪器，导致检测成本高，因此急需发展简便、快速、准确的检测方法，开发不倚赖贵重仪器设备的快速现场诊断试剂是最当前阶段的紧迫任务。 本项目的创新之处：使用环介导恒温扩增（LAMP）技术，对空调制冷系统中病原微生物，主要是具有传染性的病原体——军团菌进行诊断。该方法仅需要简单的恒温仪器即可发生；检测周期由原先的1周，缩短至2小时，这对于控制军团病爆发具有重要意义。 解决的关键问题：1）LAMP反应需要4条引物，且引物设计要求严格，且设计过程十分复杂，对军团菌目标基因的选择上（如保守区或变异区）是关系到检测特异性的关键问题，此外如何在分子水平上区分导致军团病的嗜肺军团菌和其他不治病的军团菌，对于提高检测准确度有重要意义。 2）需要在复杂的体系中灵敏特意的诊断致病菌，减少非特异性扩增反应，避免复杂成分抑制反应。使用微生物分离培养技术和滤膜抽吸过滤技术同时对空调制冷系统的循环水中分离军团菌。 3）LAMP反应体系是一个复杂体系，反应液由多种试剂构成，其用量和比例，对于反应特异性的发生有十分关键的作用。该技术问题通过正交试验得出结论加以解决，再使用单因素实验，对试剂的各种成分的优化实验。得出最适合的试剂用量和比例。 主要技术指标：提供一种快速现场检测军团菌试剂盒。
科学性、先进性
- 本项目的创新之处：使用环介导恒温扩增（LAMP）技术，对空调制冷系统中病原微生物，主要是具有传染性的病原体——军团菌进行诊断。该方法仅需要简单的恒温仪器即可发生；检测周期由原先的1周，缩短至2小时，这对于控制军团病爆发具有重要意义。 本项目的特色：使用现代分子生物学的最新研究成果，应用于环境中致病菌的快速诊断，而本项目所使用的技术改善了由于传统方法成本高、耗时、灵敏度低、特异性差的缺点。
获奖情况及鉴定结果
- 无
作品所处阶段
- 论文已发，已有试剂盒成品。
技术转让方式
- 无
作品可展示的形式
- 试剂盒成品
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 军团菌存在于空调冷却水和其它水体中，由气溶胶介导，是暴发流行或散发流行的严重呼吸道传染病，其流行致死率高达30％。本作品适用与公共场所制冷系统（例如中央空调系统）冷却水和冷凝水中军团菌的检测。对于公共安全预警、环境监测、生物反恐等领域将起到一定帮助作用。本作品具有广泛的商业与科研应用前景，如投入实际生产运用，其所带来的经济效益是非常可观的。
同类课题研究水平概述
- 本作品所展示的方法在国内尚为首次，在国际上处于领先水平。
