主办单位: 共青团中央   中国科协   教育部   中国社会科学院   全国学联  

承办单位: 贵州大学     

基本信息

项目名称:
寡糖类疫苗合成方法学探究
小类:
生命科学
简介:
我们希望探究出一种比较好的合成寡糖类疫苗方法。 首先将固相有机合成和化学酶法合成有机的结合起来,以大量的制备细胞表面糖苷用于糖生物学基础研究和药物研发。基于酶法合成的不足,我们设想通过可反复使用的连接臂将寡糖的还原端固定在树脂上,使用非天然底物引入特殊基团,先进行酶法糖链延伸,再通过化学修饰合成特殊结构的寡糖的策略。 之后,我们还设计了策略2-固相萃取法进行合成。
详细介绍:
第一代线性高分子载体的合成: 考虑到线性高分子要具有水溶性我们悬着丙烯酰胺,烯丙胺(10:1)为单体在过硫酸钾60℃下聚合6h,得到白色固体树脂1。具有极强的水溶性,但通过1H NMR分析烯丙胺比例非常少,为丙烯酰胺均聚产物,且不溶于DMF。以上这些缺点限制了我们对改高分子的进一步修饰。 第二代线性高分子载体的合成 基于前一代高分子的失败经验,我们将极性较强的丙烯酰胺替换极性相对较小的N-异丙基丙烯酰胺,希望提高产物树脂2在DMF中的水溶性。在DMF下,以AIBN为引发剂,60℃下聚合24h。反应完成后透析除去DMF和引发剂等杂质,冻干。得白色絮状固体。产物水溶性和在DMF中的溶解性均很好。但通过1H NMR分析丙烯胺比例非常少,为N-异丙基丙烯酰胺均聚产物。该产物同样不能进行进一步修饰。 第三代线性高分子载体的合成 基于前二代高分子的失败经验,我们将烯丙胺替换为N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯,在DMF下,以AIBN为引发剂,60℃下聚合24h。反应完后逐滴加入20eq乙二胺,室温搅拌24h,反应完成后透析除去DMF和引发剂等杂质,冻干。得白色絮状树脂3。产物水溶性和在DMF中的溶解性均很好。但通过1H NMR分析NH2比例与我们设计的相同。以下是所得到的高分子的氢谱,通过粘度计测定所得分子量范围5KDa-10KDa。取代度20% 在Ar气保护下,向150mg(1.2eq) NaH中加入18ml无水THF,和1ml 2-(Diethoxyphosphoryl)propionic acid ethyl ester(1eq),搅拌30min,加入α-Ketoglutaric acid diethyl ester(600mg, 3mmol),室温搅拌1h后,TLC检测反应完全。加入10mlNH4Cl饱和溶液,以乙醚(20ml×3)萃取,合并有机相以无水硫酸镁干燥,以石油醚:乙酸乙酯=10:1柱层析,得无色油状物785mg,产率91%。 760mg 3-Pentene-1,3,4-tricarboxylic acid, 1,3,4-triethyl ester溶于22ml无水乙醇,6.5ml 2M KOH水溶液中,回流1h,加入20ml 水,冷却至室温,旋转蒸发至没有有机溶剂蒸出,以二氯甲烷洗涤水相(10ml×3),冰浴下以浓盐酸调节pH值至2,搅拌20min,以乙酸乙酯萃取(20ml×3)萃取,合并有机相,干燥后旋蒸。 将酸性敏感链交联到线性树脂上 将160mg 3-Pentene-1,3,4-tricarboxylic acid, cyclic 3,4-anhydride、76μL草酰氯溶于12ml无水THF中,室温搅拌2h。将反应液旋干,溶于3ml无水DMF中,将150mg制备得到的树脂3和122μL三乙胺溶于6ml无水DMF,将酰氯的DMF溶液逐滴滴入含有树脂的溶液中室温搅拌24h后,加入9ml水,以1M HCl调节pH值至2,室温搅拌30min,以30%的乙醇透析,将透析液旋干得白色固体树脂4,取代度15%。可以明显看到树脂中酸酐的吸收信号1765.01,1715cm-1 全乙酰化2-溴乙基β乳糖苷的制备 将6.36g 4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl), 2,3,6-triacetate-β-D-Galactopyranose溶于40ml二氯甲烷和三氯乙腈(5.68g,40mmol,4eq)。在-5 ºC下逐滴加入DBU(0.42g,3mmol,0.1eq),室温搅拌1小时,TLC检测反应完全,溶液旋干后,经柱层析(二氯甲烷:乙酸乙酯=20:1),得白色固体7g。将所得三氯亚胺酯供体和2-溴乙醇溶于40ml无水二氯甲烷中,在Ar气保护下,-10ºC加入TMSOTf((0.1M, 0.13 mL, 0.02eq)的二氯甲烷溶液,室温搅拌30min,TLC检测反应完全,反应以三乙胺猝灭,旋干,经柱层析(石油醚:乙酸乙酯=2:1)得到白色全乙酰化2-溴乙基β乳糖苷4.83g,两部收率65% 全乙酰化2-叠氮乙基β乳糖苷的制备 将1.6g 2-溴乙基β乳糖苷溶于21ml无水DMF,加入1.4g叠氮钠(21.6mmol,10eq),25ºC下搅拌24h,TLC检测反应完全,将反应液倒入冰水中,以二氯甲烷(40ml×3)萃取,干燥,旋干后得到全乙酰化2-叠氮乙基β乳糖苷白色固体1.4g,产率95%。 2-叠氮乙基β乳糖苷的制备 将1.4g 全乙酰化2-叠氮乙基β乳糖苷溶于20ml无水MeOH,以甲醇钠调节pH值至8,25ºC下搅拌30min,TLC检测反应完全,以Dowex 50WX2调节pH值至7,过滤,旋干后得到2-叠氮乙基β乳糖苷白色固体690mg,产率85%。 将乳糖联到树脂上 2-叠氮乙基β乳糖苷690mg溶于10mlMeOH,加入50mg10%Pd/C,4atm下反应30min。滤除Pd/C将反应液旋干,加1ml水冻干,得白色絮状固体600mg。取出100mg与330mg树脂4溶于40ml无水DMF,加入200μL三乙胺,25ºC下搅拌12h。以水透析得到,冻干得到白色絮状固体树脂5。经1HNMR鉴定取代度约12%。树脂具有水溶性。 一锅多酶合成Siaα2-6Lac三糖 取树脂4 60mg,加入NmCSS(1mg\ml)120μL,Pd Sia2,6T(1mg\ml)240μL,Tris-HCl(1M,pH=8.0)312μL,2.5mL双蒸水,MgCl2(4.8mg,终浓度10mmol),CTP 25mg(1.5eq),唾液酸15mg,混合均匀。25ºC下100rpm下,反应12h。将反应液煮沸5min,透析后,透析袋冰浴下以PB-10pH计检测溶液pH值,以1M HCl调节pH值至3.5,25ºC下100rpm下,反应12h。将反应液以12000rpm离心,上清以P2柱分离,得目标化合物60mg,产率35%。

作品专业信息

撰写目的和基本思路

我们拟将固相有机合成和化学酶法合成有机的结合起来,大量制备细胞表面糖苷用于糖生物学基础研究和药物研发。基于酶法合成缺点,我们设想通过可反复使用的连接臂将寡糖的还原端固定在树脂上,使用非天然底物引入特殊基团,先进行酶法糖链延伸,再通过化学修饰合成特殊结构的寡糖的策略。 我组成功通过酶法合成Globo—H,我们考虑通过固相合成的策略简化分离纯化步骤,提高产率。

科学性、先进性及独特之处

策略1将固相有机合成和化学酶法合成有机的结合起来,具有如下优点: 1)我们可以通过超滤或透析等简单手段,去除反应过程中产生的UDP,未反应的供体的底物。然后,重新加入新的底物,推动反应接近完全。 2)如果某些步骤不适合固相反应,由于连接臂可以反复使用,我们可以使用“take-off”的策略,不会影响后续固相合成 3)可以在酶法合成完成后,通过化学修饰得到特殊的结构。

应用价值和现实意义

本课题致力于开发的基于固相的化学酶法合成方法及其固相萃取法,将有效的推动糖化学,糖生物学及寡糖类药物的研发,具有极高的理论价值。合成得到的寡糖类抗原及其糖蛋白复合物,很有潜力成为新一代的疫苗,从而产生巨大的经济效益。

学术论文摘要

建立一个基于对pH值敏感的水溶性聚合物的多糖的酶催化合成的总体战略。在中性条件下,聚合物具有水溶性,并且利于酶催化反应的进行。而在酸性条件(pH值低于4.0),产品从聚合物中脱离,显示出不溶解性,可以很容易地从反应体系中分离出来。6-Sialyl LN的类似物就可以通过这种方法合成。

获奖情况

南开大学本科生创新科研优秀项目三等奖

鉴定结果

参考文献

Cancer Vaccine Globo-H carbohydrate antigens Solid phase Chemical Enzymatic Strategy Solid phase extraction technology

同类课题研究水平概述

近年来的研究表明,细胞表面的糖抗原的表达量通常在细胞癌化过程中大大增加,而且某些特定的寡聚糖只在某些特定的癌细胞上表达。例如,Globo—H通常在卵巢癌、胰腺癌,前列腺癌,乳腺癌和直肠癌中过量表达。因此寡糖抗原成为一种潜在的肿瘤疫苗分子。目前,以寡糖分子为基础的一系列衍生物已进入临床试验阶段。结果表明这种疫苗在绝大多数的病人体内产生免疫反应,并且没有自免疫的副作用产生。 单糖结构的化学修饰可以增加多糖疫苗的免疫原性。化学修饰的带有非自然的N-acyl的侧链的sialic aid残基,与相应的自然的sialic aid疫苗相比具有更强的免疫原性。Globo—H与KLH的复合物已进行了临产前的试验,正在进行临床试验。临产前的试验结果表明,该糖蛋白复合物可有效的刺激人免疫系统产生抗体 发展寡糖类疫苗存在这三个技术瓶颈: 1)发展寡糖类疫苗的技术瓶颈之一:稀有单糖糖库的构建 寡糖抗原往往含有稀有的单糖,现有的单糖合成策略主要有两条:“糖到糖”和“非糖到糖”。就合成设计而言,构建糖库比合成单一个体更具有挑战性。对于构建糖库,好的合成设计往往需要有“收束性”(convergent design),即合成是从数目较少的关键中间体出发,经过较短的路线来完成。目前为止,用于构建糖库的收束性设计凤毛麟角。 2) 发展寡糖类疫苗的技术瓶颈之二:寡糖合成(酶法的应用) 在生物大分子中,多肽和寡核苷酸的合成技术已经十分成熟,自动化的合成已经实现商业应用;相比之下,寡糖合成技术的发展却大大滞后。主要原因是由于寡糖链的立体化学更为复杂;直链或支链、呋喃环间的多种连接方式以及糖苷链的α/β构型等等因素。 寡糖的合成有化学和生物酶法合成两种,他们相互优劣,互为补充。酶法多用于合成某一特定的(天然)寡糖,如α-Gal,ABO血型抗原,志贺毒素(Shiga toxin)的受体Gb3等;化学法则更适合于(天然)寡糖的衍生化。 3) 发展寡糖类疫苗的技术瓶颈之三:刺激免疫的载体的选择 寡糖类抗原是较弱的抗原,需要选择合适的抗原才能刺激免疫反应,现在选用的有BSA,KLH,TT,DT等。
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