基本信息
- 项目名称：
- 鸡β-防御素AvBD-5真核载体构建及免疫活性的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本文设计构建带有鸡β-防御素AvBD-5基因的SEp9 DNA疫苗，将重组质粒导入小鼠体内，使小鼠获得对肠炎沙门氏菌的抗性，为研究SEp9 DNA疫苗和AvBD-5作为内源免疫物质的免疫作用免疫活性在家禽养殖业中的应用，将其作为一种高效无毒、无残留的免疫促进剂替代抗生素，提高家禽抗病力以及禽产品的安全性，对禽类的生产以及禽产品的安全具有重要的意义。
- 详细介绍：
- 前言 本文设计构建带有鸡β-防御素AvBD-5基因的SEp9 DNA疫苗，将重组质粒导入小鼠体内，使小鼠获得对肠炎沙门氏菌的抗性，为研究SEp9 DNA疫苗和AvBD-5作为内源免疫物质的免疫作用免疫活性在家禽养殖业中的应用，将其作为一种高效无毒、无残留的免疫促进剂替代抗生素，提高家禽抗病力以及禽产品的安全性，对禽类的生产以及禽产品的安全具有重要的意义。 材料与方法 采用PCR的方法扩增AvBD-5及SEp9基因，分别构建重组真核表达载体pVAX1-AvBD5、pVAX1-SEp9及pVAX1-SEp9-AvBD5；用去内毒素质粒抽提法获得高纯度无内毒素重组真核表达质粒，作为DNA疫苗免疫动物后，用ELISA检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平，实时荧光定量PCR法检测肠组织中MCP-1基因表达量差异，分离小鼠淋巴细胞，用流式细胞术分析T淋巴细胞亚群含量变化，在首免后第42天用肠炎沙门氏菌对小鼠攻毒，检测免疫保护效率。 设计AvBD-5 DNA疫苗和SEp9 DNA疫苗，单独或联合的体液免疫、粘膜免疫方式导入到动物体内，使其获得对肠炎沙门氏菌的抗性，初步测定AvBD-5 DNA疫苗和SEp9 DNA疫苗的免疫效应并研究DNA疫苗的保护效应和鸡β-防御素AvBD-5的免疫活性， 结果 研究结果表明pVAX1-SEp9、pVAX1-SEp9-AvBD5均能在小鼠体内刺激免疫应答，产生抗SEp9的特异性抗体，pVAX1-SEp9-AvBD5组的IgG抗体OD450nm与对照组相比最高，达到0.33，同时能诱导肠组织产生MCP-1，引起T淋巴细胞亚群增殖，与对照相比，最高分别为63.17%、43.11%、20.57%。攻毒后pVAX1-SEp9组和pVAX1-SEp9-AvBD5组中小鼠新鲜粪便中SE菌落数与对照组相比明显下降，pVAX1-SEp9-AvBD5组在攻毒后的第4天，粪便中仅含SE 22.90CFU/g。 结论 实验首次将AvBD5同时作为抗菌多肽和内源免疫物质研究其对肠炎沙门氏菌的免疫增强作用，探寻AvBD5作为一种新型免疫佐剂使用的可能性。研究结果证明了鸡β-防御素AvBD-5能有效刺激鸡的免疫防御系统，增加机体特异性免疫应答的能力，提高了小鼠对肠炎沙门氏菌感染的保护效率，为AvBD-5作为一种新型免疫佐剂，应用于DNA疫苗的研究与开发奠定了基础。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 禽类是众多病原体的携带者，病原体造成禽类产品污染，同时也威胁人类健康。在抗生素替代剂中，抗菌肽具有广谱抗菌活性、抗病毒和免疫增强等作用，对机体无毒害、无残留等，备受关注。 本实验在已有研究的基础上，设计AvBD-5 DNA和SEp9 DNA疫苗，单独或联合的体液、粘膜免疫方式导入到动物体内，测定AvBD-5 DNA和SEp9 DNA疫苗的免疫效应。以此研究预防禽肠炎沙门氏菌感染的DNA疫苗。
科学性、先进性及独特之处
- 1.首次从粤黄鸡舌头组织中克隆鸡β-防御素AvBD5成熟肽基因 2.将IRES插入真核表达载体pVAX1的多克隆位点中，构建双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES，并将SEp9基因和AvBD5成熟肽基因插入双顺反子载体中，构建了共表达载体该载体可同时独立的表达SEp9基因和AvBD5成熟肽基因 3.首次将AvBD5同时作为抗菌多肽和内源免疫物质，探寻AvBD5作为新型免疫佐剂使用的可能性
应用价值和现实意义
- 本研究旨在发展完善一种新型高效的预防家禽肠炎沙门氏菌感染的DNA药物，研究禽β-防御素AvBD-5的免疫活性，并探讨能使其作为一种新型免疫佐剂的可能性。本研究设计构建带有鸡β-防御素AvBD-5基因的DNA疫苗，将重组质粒导入模式动物小鼠体内，使其获得对肠炎沙门氏菌的抗性，并研究DNA疫苗的保护效应和鸡β-防御素AvBD-5的免疫活性。为AvBD-5作为佐剂，应用于DNA疫苗的研究开发奠定基础。
学术论文摘要
- AvBD是禽类先天内源免疫防御系统重要组成部分。本文构建了3个重组真核表达载体： pVAX1-AvBD5、pVAX1-SEp9和共表达载体pVAX1-SEp9-AvBD5。将3个重组质粒作为DNA疫苗免疫小鼠。检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平，实时荧光定量PCR法检测肠组织中MCP-1基因表达量差异；分离小鼠淋巴细胞，用流式细胞术分析T淋巴细胞亚群含量变化。检测免疫保护效率，结果表明pVAX1-SEp9、pVAX1-SEp9-AvBD5均能在小鼠体内刺激免疫应答，产生抗SEp9的特异性抗体小鼠新鲜粪便中SE菌落数与对照组相比明显下降。本研究证明了鸡AvBD-5能有效刺激鸡免疫防御系统，增加机体特异性免疫应答能力，提高小鼠对SE感染的保护效率。 研究结果证明了鸡β-防御素AvBD-5能有效刺激鸡的免疫防御系统，增加机体特异性免疫应答的能力，提高了小鼠对肠炎沙门氏菌感染的保护效率，为AvBD-5作为一种新型免疫佐剂，应用于DNA疫苗的研究与开发奠定了基础。
获奖情况
- 2010年华南农业大学“丁颖杯”课外学术科技作品竞赛二等奖
鉴定结果
- 经广东省团委鉴定属实
参考文献
- 1、pVAX1-SEp9-AvBD5试验组流式细胞术结果示意图 2、Meade K G, Higgs R, Lloyd A T, et al. Differential antimicrobial peptide gene expression patterns during early chicken embryological development. Developmental and Comparative Immunology, 2009, (33): 516-524 3、Van Dijk A, Veldhuizen E J, Kalkhove S I, et al. The β-defensin gallinacin-6 is expressed in the chicken digestive tract and has antimicrobial activity against food-borne pathogens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2007, 51(3): 912-922 4、Van Dijk A, Veldhuizen E J, Haagsman H P. Avian defensins. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2008, 124 (1-2): 1-18 5、韩宗玺, 马得莹, 刘胜旺等. 重组鸡抗菌肽Gallinacin-9的原核表达及其抗菌活性的鉴定. 畜牧兽医学报. 2008, 39(10): 1426-1431 6、廖文艳, 马得莹, 韩宗玺等. 重组鸡β-防御素10蛋白的原核表达及其抗菌活性的测定. 中国预防医学报. 2008, 10(30): 765-769
同类课题研究水平概述
- 肠炎沙门氏菌不仅能引起家禽发病死亡造成严重的经济损失，而且感染家禽的产品作为肠炎沙门氏菌的携带者，还严重危害人类健康。日、美等发达国家发生的食物中毒事件中40%-80%是由禽沙门氏菌引起的，其中主要病原为肠炎沙门氏菌，每年在美国由于食物传播沙门氏菌感染致死的超过600人，140万人染病，每年都要花费4.64亿到23亿美金用于治疗食物传播沙门氏菌感染。由肠炎沙门氏菌引起人的急性胃肠炎，在世界各国有增加的趋势，已成为国际公共卫生的一个重要课题。 饲用抗生素被广泛地用于降低禽类发病率和维持健康。然而，长期使用抗生素会导致抗生素在禽产品中残留及细菌耐药性的产生，并通过食物链威胁人类健康。因此，需要一种既有效又环保的新方法来控制禽类疾病。在众多的抗生素替代剂中，抗菌肽由于其分布广泛、具有广谱抗菌活性、抗病毒和免疫增强等作用，并且对机体无毒害、无残留等，越来越受到关注。 防御素是一类重要的内源性抗菌肽，具有较强的广谱抗菌活性，在机体免疫中发挥着重要的作用。鸡的染色体共编码14种β防御素，被称为AvBD1-14。鸡β防御素作为鸡的重要天然免疫屏障，广泛分布于鸡体内各种组织器官中，在鸡的先天性免疫和获得性免疫中都具有重要的作用。 利用商品化SE菌苗作为疫苗是用来控制SE污染的一种方法。然而，SE菌苗存在的内毒素可能会对鸡产生潜在的危害。因此， SE亚单位疫苗的研制已经被提出。已经报道了SE鞭毛抗原可以作为疫苗的巨大潜力。SE鞭毛抗原最主要的成分是FliC抗原，而FliC抗原最主要的抗原位点是SEp9。Yukiko Toyota-Hanatani等人（2009）用SEp9和弗氏完全佐剂联合接种鸡，然后口服攻毒SE，与对照相比，SEp9的SE菌数量显著降低，证明了SEp9抗原是一个有效的抗原，能有效的抑制SE在鸡肠道的定殖。Yukiko Toyota-Hanatani等人（2008）从组织学上证明了SEp9可以成为SE亚单位疫苗的候选抗原。注射SEp9后，鸡体内能产生特异性抗体，且在注射部位周围能引起血管淋巴细胞的积聚。他们的研究显示：SEp9作为一个亚单位疫苗，在鸡SE感染后的连续免疫反应和抗原递呈中都具有重要的作用。
