基本信息
- 项目名称：
- EBI3蛋白基因克隆、表达、多克隆抗体制备及其鉴定
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究采用分子生物学方法原核表达重组鼠EBI3（Epstein-Barr virus-induced gene3）蛋白，Western blot对其鉴定，用重组蛋白免疫小鼠制备并纯化得到抗重组鼠EBI3蛋白多克隆抗体，ELISA检测其免疫反应性。为进一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中功能的研究奠定了基础。
- 详细介绍：
- EB病毒诱导基因3（Epstein-Barr virus-induced gene3,EBI3）蛋白最先是在B淋巴细胞受EB病毒感染后的表达产物中发现的，与IL-12-p40亚基和睫状神经营养因子受体（ciliary neurotrophic factor receptor，CNTFR)同源，属于造血因子受体家族。 EBI3蛋白的已知存在形式有三种：与p28组成异二聚体IL-27，与p35组成异二聚体IL-35和同二聚体。在人类淋巴组织中，EBI3蛋白已经在扁桃体、脾脏中被发现以及在正常妊娠足月胎盘中高表达，EBI3蛋白在霍奇金淋巴瘤里同样高度表达。 最近有大量研究聚焦在IL-27对T细胞的调节上。IL-27通过激活初始CD4+ T 细胞的Jak/STAT通路来诱导T-bet和IL-12受体β2链的表达，协同IL-12刺激初始CD4+ T 细胞向Th1方向化;Toxoplasma gondii感染小鼠模型中IL-27又可以抑制过度的Th1反应;最近还证实了IL-27对Th17细胞有抑制作用。Liew等人发现IL-35可以抑制Th17细胞的分化,同二聚体的功能尚不清楚。Th17细胞是最近被确定为不同于Th1细胞和Th2细胞的CD4+ T细胞的一个新的亚群，通过分泌IL-17， IL-21，IL-22等炎症因子，在宿主防御反应和自身免疫性疾病中具有重要的调节作用。 EBI3蛋白的存在形式和表达部位都显示EBI3蛋白在免疫系统中具有重要功能。为此， 本研究采用分子生物学方法原核表达重组鼠EBI3蛋白，Western blot对其鉴定，用重组蛋白免疫小鼠制备并纯化得到到抗重组鼠EBI3蛋白IgG抗体，ELISA检测其免疫反应性。为进一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中功能的研究奠定了基础。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 本研究采用分子生物学方法原核表达重组鼠EBI3（Epstein-Barr virus-induced gene3）蛋白，Western blot对其鉴定，用重组蛋白免疫小鼠制备并纯化得到抗重组鼠EBI3蛋白多克隆抗体，ELISA检测其免疫反应性。为进一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中功能的研究奠定了基础。
科学性、先进性及独特之处
- 经查文献，未发现关于原核表达重组鼠EBI3蛋白和制备抗重组鼠EBI3蛋白多克隆抗体的报道，IL-27与IL-35对Th17细胞均有负调控作用，EBI3蛋白作为IL-27与IL-35的共同亚基，所以对EBI3蛋白的研究无疑为进一步探讨EBI3蛋白的功能及其对Th-17细胞的调控作用奠定了理论和实验基础。
应用价值和现实意义
- 国外在研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中的功能时，几乎用的都是EBI3或WSX-1（IL-27受体的亚基之一）基因敲除小鼠，而国内对EBI3蛋白的研究鲜有报道。大量研究聚焦在IL-27对IL-17的负调控上，而抗重组鼠EBI3蛋白多克隆抗体与重组鼠EBI3蛋白均有可能作用于小鼠IL-27/IL-35与其受体，从而影响IL-27/IL-35的功能，进而影响到IL-17的分泌。
学术论文摘要
- 目的 构建鼠EB病毒诱导基因3（Epstein-Barr virus-induced gene3,EBI3）的原核表达质粒,体外表达纯化后制备多克隆抗体。方法 收集日本血吸虫感染的C57BL/6小鼠脾细胞后提取总RNA,利用所合成引物经RT-PCR获得EBI3的cDNA，将该基因亚克隆入原核表达载体pET32a(+),转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，对包涵体进行变性、纯化和复性后获得可溶性的重组鼠EBI3蛋白，Western blot对其鉴定。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠获取血清，经饱和硫酸铵法和DEAE-Sephadex A-50柱纯化得到抗重组鼠EBI3蛋白多克隆抗体，ELISA检测其免疫反应性。结果及结论 基因工程获得目的蛋白复性成功后经Western blot鉴定证实为重组鼠EBI3蛋白，免疫小鼠后取血清，分离纯化获得抗重组鼠EBI3蛋白多克隆抗体，ELISA结果表明该蛋白具有一定的免疫反应性。为进一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中功能的研究奠定了基础。
获奖情况
- 第三届“挑战杯”合锻集团安徽省大学生课外学术科技作品竞赛 一等奖
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Pflanz S, Timans JC, Cheung J, et al. IL-27, a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein, induces proliferation of naive CD4(+) T cells. Immunity, 2002; 16:779-790. [2] Christopher A, Alejandro V, David A, et al. The role of IL-27 in the development of T-cell responses during parasitic infections. Immunological Reviews, 2004; 202:106-114. [3] John C, Paul R. All in the family: IL-27 suppression of TH-17 cells. Nature Immunology, 2006; 7:899-902. [4] Niedbala W, Wei X, Cai B, et al. IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells. Eur J Immunol, 2007; 37:3021-3029. [5] 张玉侠. 效应分子IL-17的抗感染作用. 国际免疫学杂志, 2009; 32(3):241-244. [6] Jianfei Yang, Min Yang, Tin Min Htut, et al. Epstein-Barr virus-induced gene 3 negatively regulates IL-17, IL-22 and RORγt. Eur J Immunol, 2008; 38:1204-1214.
同类课题研究水平概述
- EBI3蛋白最先是在B淋巴细胞受EB病毒感染后的表达产物中发现的，与IL-12-p40亚基和睫状神经营养因子受体（ciliary neurotrophic factor receptor，CNTFR)同源，属于造血因子受体家族。 EBI3蛋白的已知存在形式有三种：与p28组成异二聚体IL-27，与p35组成异二聚体IL-35和同二聚体。在人类淋巴组织中，EBI3蛋白已经在扁桃体、脾脏中被发现以及在正常妊娠足月胎盘中高表达，EBI3蛋白在霍奇金淋巴瘤里同样高度表达。 最近有大量研究聚焦在IL-27对T细胞的调节上。IL-27通过激活初始CD4+ T 细胞的Jak/STAT通路来诱导T-bet和IL-12受体β2链的表达，协同IL-12刺激初始CD4+T细胞向Th1方向转化;Toxoplasma gondii感染小鼠模型中IL-27又可以抑制过度的Th1反应;而且最近也证实了IL-27对Th17细胞有抑制作用。Liew等人发现IL-35可以抑制Th17细胞的分化,同二聚体的功能尚不清楚。Th17细胞是最近被确定为不同于Th1细胞和Th2细胞的CD4+ T细胞的一个新的亚群，通过分泌IL-17， IL-21，IL-22等炎症因子，在宿主防御反应和自身免疫性疾病中具有重要的调节作用。 国外在研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中的功能时，几乎用的都是EBI3或WSX-1（IL-27受体的亚基之一）基因敲除小鼠，而国内对EBI3蛋白的研究鲜有报道。大量研究聚焦在IL-27对IL-17的负调控上，IL-17是新发现的具有强大促炎作用的细胞因子，通过诱导多种细胞（具有IL-17R的细胞）表达细胞因子和趋化因子来促进中性粒细胞的分化、迁移，一方面在自身免疫性疾病发挥重要致病作用；另一方面，IL-17还与抗感染免疫有关，在抵抗细菌及真菌的保护性免疫反映中发挥重要作用。与IL-27具有共同亚基EBI3蛋白的IL-35对IL-17也有负调控作用，Jianfei Yang等人发现用OVA（鸡卵蛋白）刺激EBI3基因敲除小鼠脾细胞比刺激正常小鼠脾细胞后IL-17的分泌量明显增高。
