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基本信息

项目名称:
Construction of pcDNA3-CIRP and pECFP-C1-CIRP and
小类:
生命科学
简介:
构建冷诱导RNA结合蛋白(cold inducible RNA binding protein ,CIRP)的两个重组质粒pcDNA3-CIRP 和pECFP-C1-CIRP,将其转入NIH3T3 细胞并成功实现真核表达。筛选获得pECFP-C1-CIRP稳定表达的NIH3T3 细胞株,荧光显微镜观察绿色荧光主要分布于细胞质和细胞外,冷诱导凋亡实验提示CIRP在保护细胞免受冷凋亡中具有重要作用。
详细介绍:
冷应激是生物机体适应低温的生理性反应。如果寒冷刺激对细胞的损伤作用超过了修复能力,则诱导细胞发生凋亡或坏死。动物都是通过启动与抗冷性有关的基因和表达,给出逆境保护措施,从而协助动物度过难关或逆境的。现已经发现,抗冷能力与动物基因组中抗冻蛋白基因的拷贝个数成正比。构建冷诱导RNA结合蛋白(cold inducible RNA binding protein ,CIRP)是冷应急反应中一个重要的保护性蛋白。本研究从冷处理后的BALB/C小鼠睾丸组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增CIRP的cDNA,构建重组入真核表达载体pcDNA3 和pECFP-C1,通过酶切鉴定筛选出阳性重组菌;利用脂质体法将2种重组质粒pcDNA3-CIRP 和pECFP-C1-CIRP以及空白对照质粒分别转染NIH3T3 细胞, 36h 后荧光倒置显微镜及RT-PCR方法观察及鉴定CIRP在细胞中的表达情况,结果表明重组表达质粒构建正确并获得了表达;同时对pECFP-C1-CIRP 转染组进行G418加压筛选,荧光显微镜观察所有细胞均呈现较强绿色荧光,表明成功筛选获得稳定表达的细胞株,而绿色荧光主要分布于细胞质和细胞外,说明随着加压筛选CIRP 融合蛋白被分泌出细胞外;最后将转染后的细胞于4℃、14℃、24℃ 条件下进行冷诱导凋亡实验,经Hoechst33258荧光染色法后,细胞凋亡荧光显微镜检测结果表明转染CIRP基因的细胞组凋亡程度小于对照组,在保护细胞免受冷凋亡过程中具有重要作用。

作品图片

  • Construction of pcDNA3-CIRP and pECFP-C1-CIRP and
  • Construction of pcDNA3-CIRP and pECFP-C1-CIRP and
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作品专业信息

撰写目的和基本思路

本研究为探究冷诱导RNA 结合蛋白CIRP是否具有对抗冷诱导的细胞凋亡的生物保护功能。首先构建CIRP的两个真核表达载体,在真核细胞内实现CIRP的成功过表达。然后对比能够稳定表达CIRP的细胞株与转染空载体细胞株株以及野生株在冷刺激条件下的凋亡率,验证CIRP是否具有保护细胞免受冷诱导的凋亡损伤的作用。

科学性、先进性及独特之处

冷诱导RNA 结合蛋白CIRP被鉴定出来之后多应用于肿瘤、紫外线应激、缺氧缺血应激以及冬眠和昼夜节律调节等多方面的研究,并得到大量的证据证明CIRP是多功能的保护性蛋白。但是国内外还未曾有资料报道这个在冷的条件下被大量诱导的蛋白对冷刺激自身所导致的凋亡是否具有抵抗作用。本研究首次提出并初步证明CIRP具有对抗冷诱导的细胞凋亡的作用。

应用价值和现实意义

本论文开展有关冷诱导细胞凋亡以及用基因工程手段进行调控的研究对移植器官医学领域具有重要的参考和应用价值,不仅有利于深入探讨冷诱导细胞凋亡的分子机制,而且有利于寻求新的阻断冷诱导细胞凋亡的方法。

学术论文摘要

本研究从冷处理后的BALB/C小鼠睾丸组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增CIRP的cDNA,构建重组入真核表达载体pcDNA3 和pECFP-C1,通过酶切鉴定筛选出阳性重组菌;利用脂质体法将2种重组质粒pcDNA3-CIRP 和pECFP-C1-CIRP以及空白对照质粒分别转染NIH3T3 细胞, 36h 后荧光倒置显微镜及RT-PCR方法观察及鉴定CIRP在细胞中的表达情况,结果表明重组表达质粒构建正确并获得了表达;同时对pECFP-C1-CIRP 转染组进行G418加压筛选,荧光显微镜观察所有细胞均呈现较强绿色荧光,表明成功筛选获得稳定表达的细胞株,而绿色荧光主要分布于细胞质和细胞外,说明随着加压筛选CIRP 融合蛋白被分泌出细胞外;最后将转染后的细胞于4℃、14℃、24℃ 条件下进行冷诱导凋亡实验,经Hoechst33258荧光染色法后,细胞凋亡荧光显微镜检测结果表明转染CIRP基因的细胞组凋亡程度小于对照组,在保护细胞免受冷凋亡过程中具有重要作用。

获奖情况

该研究的前期工作曾在中国畜牧兽医学会动物生理生化学分会第9次和第10次(广州、昆明)学术会议上进行专题报告,同时在中国生理学会东北三省生理学会(大连)进行报告。特别是该研究收到第36届国际生理学大会邀请,于2009年7-8月在日本京都召开的第36届国际生理学大会进行墙报展示和交流,得到世界生理学界学术同仁的认可与好评。该研究的前期工作基础曾在《Journal Agricultural Science and Technology USA》,《生理科学进展》等国内外期刊发表学术论文近10篇。其中“BALB/C鼠睾丸组织中冷诱导RNA结合蛋白的cDNA克隆与序列分析”,获2009年大庆市第23届自然科学技术成果(论文类)三等奖,“Cloning and Sequence Analysis of Cold Inducible RNA-binding Protein cDNA from Testis Tissue in BALB/C Mice”获2010年第11届黑龙江省自然科学技术成果(论文类)三等奖。 目前,该论文正在接受《Journal of Biomedical Science and Engineering》杂志的专家评审,即将在线全文发表。

鉴定结果

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参考文献

[1] Peng Y, Yang PH, Tanner JA, Huang JD, Li M, Lee HF, Xu RH, Kung HF, Lin MC. (2006) Cold-inducible RNA binding protein is required for the expression of adhesion molecules and embryonic cell movement in Xenopus laevis. Biochem Biophys Res Commun 344:416-424. [2] Sakurai T, Itoh K, Higashitsuji H, Nonoguchi K, Liu Y, Watanabe H, Nakano T, Fukumoto M, Chiba T, Fujita J. (2006) Cirp protects against tumor necrosis factor-α-induced apoptosis via activation of extracellular signal-regulated kinase. Biochim Biophys Acta 1763:290–295. [3] Sambrook J, Russell W. Molecular Cloning:A Laboratory manual. 3rd ed. Beijing:Science Press, (in chinese) (2002). [4] Wellmann S, Buhrer C, Moderegger E, Zelmer A, Kirschner R, Koehne P, Fujita J, Seeger K. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1 -independent mechanism. J. Cell Sci., 117:1785–1794 (2004).

同类课题研究水平概述

1997年Nishiyama H等[1]首次从小鼠睾丸细胞中分离了冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein, CIRP)的cDNA,具有介导冷诱导的细胞生长抑制作用。CIRP 在结构上,它具有重要的RNA结合基序之一—RNP基序,可能参与基因表达的转录后调节如mRNA剪接、稳定、转运和多腺苷酸化[2]。在植物体中,许多属于同一RNP家族的蛋白质主要在分生组织和生长组织中表达,被推测与植物生长调节和外界刺激反应相关。在大肠杆菌内,冷休克蛋白A是主要的冷休克蛋白之一,与低温环境下的细胞生长和蛋白质合成有关[3]。类似的是,低温影响CIRP在动物细胞中的表达,介导以DNA合成前期延长为主要特征的哺乳动物细胞生长抑制,参与调节相关蛋白合成来到达自身保护的作用,这是细胞对低温的一种适应性反应,对生物体生存具有重要意义[4]。 同时,CIRP也在其他多种哺乳动物小鼠、人类、大鼠、墨西哥美西螈、牛蛙、非洲爪蛙和鲑鱼等细胞中被发现,但蛋白的细胞定位具有特异性,种属不同蛋白的定位也有差异;CIRP在其他应激压力下也能被诱导表达,如紫外线照射、高渗透压和缺氧条件等[4,5,6];CIRP参与许多生物学过程,发挥着不同的生物学功能,而不仅仅只参与人和动物冷应激过程,可以说它是一种重要的生物机体多功能蛋白。它可能会为揭示人和动物冷应激反应的调节机制提供一条线索[1,7],可能会为阐明雄性不育症的分子机制提供启示[8],可能调节两栖动物冬眠活动[9],可能参与正常子宫内膜周期调节及其癌症发生[10];它参与人和动物神经发育调节[11]以及非洲爪蟾和墨西哥美西螈胚胎发育过程[12,13]。 细胞凋亡(apoptosis),又名细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD),是用来定义PCD 过程中一些共同的形态学特征, 通过细胞内固有的生理生化反应或某种酶的活化而导致的细胞死亡。 Sakurai T等[14] 通过体外细胞实验,分析在适度低温条件下培养细胞和CIRP表达对细胞凋亡的影响,发现CIRP 能够凭借激活细胞外信号调节激酶途径,防止肿瘤坏死因子α 诱导的细胞凋亡。寒冷刺激同样能够导致细胞膜脂过氧化,细胞水肿,细胞膜弹性、通透性以及细胞内各种细胞器形态发生改变,进而引起细胞凋亡。
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